jueves, 15 de enero de 2009

Fijación de Muestras Biológicas

Fijadores Químicos

Los métodos químicos de fijación ofrecen los mejores resultados. Estos métodos utilizan líquidos que difunden hacia la profundidad de la muestra para alcanzar y desnaturalizar las enzimas que provocan la autólisis tisular. Los reactivos utilizados tienen capacidad de interactuar con los componentes del tejido, tales como proteínas, glicoproteínas, proteoglicanos, lípidos, glicolípidos, lipoproteínas, pigmentos, ácidos pécticos y nucleicos; como así también, la capacidad de preservar la composición y localización de carbohidratos: celulosa y almidón en vegetales, quitina en insectos o glucógeno en tejidos animales y depósitos metálicos (Fe+2, Cu+2, Al+3, Cd+2, Pb+2, As-3, Cr+2). La fijación química involucra el uso de soluciones orgánicas e inorgánicas que permiten la adecuada preservación de la morfología tisular y propiedades tintoriales de las macromoleculas del tejio. Estas soluciones se dividen en dos grandes grupos:





1. Fijadores Coagulantes: son soluciones que pueden coagular proteínas, transformándolas en estructuras insolubles. Debido a que la arquitectura del tejido se mantiene fundamentalmente por lipoproteínas (uno de los principales componentes de membranas plasmáticas), por proteínas fibrosas (colágeno) y globulares (nucleoproteínas), la coagulación de estas proteínas mantiene la morfología del tejido a nivel de microscopía de luz, si bien la fijación por coagulación produce floculación citoplasmática, como así también, preservación pobre de mitocondrias y gránulos de secreción.

2. Fijadores No Coagulantes: estas soluciones interaccionan con diferentes sitios químicos de las macromoléculas tisulares para establecer, a modo de puente, uniones que originan una malla que las entrelaza. A diferencia de los fijadores coagulantes, la eliminación de las moléculas de agua a partir del tejido es mucho menor, haciendo que la mayoría de los componentes tisulares se conserve adecuadamente. De esta manera y de acuerdo a los efectos que se desencadenan en el tejido, la fijación se produce por deshidratación, reticulización, formación de sales o por cambio de estado coloidal:





Fijación por Deshidratación
Los reactivos fijadores que se describen a continuación, presentan gran compatibilidad química con las moléculas de agua, vía puentes hidrógeno. Los lípidos se disuelven rápidamente, a excepción de los fosfolípidos; mientras que los carbohidratos permanecen conservados dependiendo de la precipitación proteica. Los ácidos nucleicos se fijan correctamente.

Etanol: también llamado alcohol etílico (C2H5OH) es un fijador coagulante, no aditivo y de bajo potencial de ionización (0.45 volt.), suele emplearse solo. Penetra lentamente el tejido produciendo contracción de la muestra y endureciéndola. Es miscible en agua en todas sus proporciones y compatible con todos aquellos fijadores que no tienen actividad oxidante fuerte. No produce efectos de sobrecoloración. Provoca la precipitación de las proteínas por extracción de la capa de agua que las solvata pero sin desnaturalizarlas.
La acción más potente corresponde a las soluciones más concentradas (96º ó 100º). Para fijar fragmentos de 5 mm de espesor es suficiente con 6 horas de acción. Si el tamaño de la muestra es mayor se corre el riesgo de que las capas superficiales se endurezcan demasiado y éste no pueda penetrar aún más como para alcanzar las capas más profundas. Las soluciones etanólicas menos concentradas tienen un efecto macerador de la muestra (70º), por tanto, no se utilizan como fijador. Precipita por coagulación la totalidad del citoplasma, las mitocondrias se distorsionan, los glóbulos lipídicos difunden o disuelven y provoca ligera contracción nucleolar.
Metanol: conocido como alcohol metílico (CH3OH) es un fijador no aditivo que, generalmente, se utiliza solo y cuyo potencial de oxidación es inferior al del etanol. Esto hace que tenga mayor poder reductor y, por tanto, se lo recomiende para la fijación de ácidos nucleicos y en la impregnación argéntica de regiones organizadoras del nucleolo. Es un excelente fijador para citología exfoliativa general. Al igual que el etanol es miscible en agua y forma puentes hidrógeno con las moléculas de agua del tejido, las que extrae con rapidez coagulando proteínas. Es muy adecuado para la realización de métodos enzimo e inmunohistoquímicos e hibridación in situ.



Acetona: es un agente no aditivo y muy oxidante (0.65 volt.), debido a que el átomo de oxígeno puede compartir coordinadamente un par de electrones. Su fórmula es CH3COCH3 y deshidrata violentamente. Es miscible en agua e incompatible con fijadores metálicos bivalentes. Generalmente se la emplea sola. Es recomendada para ácidos nucleicos y en protocolos de inmunofluorescencia directa para la detección de complejos autoinmunes (biopsia renal, hepática, piel o mucosa). También se la puede emplear en determinados estudios con microscopio electrónico de transmisión.
Al igual que los anteriores, disuelve los lípidos y los carbohidratos quedan conservados debido a la correcta precipitación de las proteínas. Sin embargo, la rápida extracción del agua desde el tejido provoca una contracción nuclear, que deja un halo perinuclear, especialmente, en los epitelios.


Fijación por Reticulización
La acción de estos fijadores aditivos produce la liberación de moléculas de agua a partir las proteínas que constituyen los tejidos, originando grupos químicos de carga catiónica y aniónica en los aminoácidos laterales para establecer, de manera anárquica, estructuras fibrilares que promueven la formación de compuestos reticulados en estado de gel.

Formaldehído: fue introducido como fijador en 1896 por el biólogo Federic Blum, durante un experimento que realizaba con ratones que presentaban antrax, mientras los trataba con distintos desinfectantes. Su fórmula molecular es H2CO. El formaldehído es un gas incoloro de olor picante. Es muy soluble en agua y licua en recipiente cerrado a –19ºC, alcanzando una concentración final del 40% p/v. El formaldehído se lo conoce también como formalina, metanal o formol, aunque esta última denominación ha llevado a serias discusiones, ya que el sufijo “ol” se lo emplea para designar alcoholes y el formol es un aldehído. En estado monomérico, el formaldehído se presenta en agua como metilenglicol (HO-CH2-OH), el cual se une entre dos proteínas muy próximas, a modo de puente o, entre dos sitios compatibles de una misma proteína. Si la solución queda estacionada durante largo tiempo, comienza a polimerizar dando origen a un polímero de peso molecular múltiple (de 6 a 100 unidades), conocido como “paraformaldehído”:

HO-CH2O- (CH2-O-CH2-O-CH2-O-CH2)n -OCH2-OH (Polímero lineal)

El paraformaldehído se deposita en el fondo del frasco en forma de un polvo blanco. Para redisolverlo, se agrega Hidróxido de sodio 1N, gota a gota lentamente y en baño María a 50ºC, agitando hasta que la solución quede perfectamente límpida. Una vez disuelto, por alcalinización, se adiciona agua destilada hasta alcanzar el volumen inicial, a fin de asegurarnos que la concentración del reactivo sea al 40%. Para evitar que este polímero se origine a partir del formol comercial, tras abrir el frasco, agregamos 1 ml de alcohol metílico, con el propósito de favorecer la formación de metilenglicol, de acuerdo a lo informado por Kingsbury en 1912 (citado por Baker 1958).





De esta manera, el formol reúne la mayoría de las cualidades esenciales que debe tener un reactivo de fijación y, por ello, se lo llama Fijador Universal, ya que permite realizar técnicas de rutina, como así también métodos enzimo e inmunohistoquímicos, PCR e ISH in situ, autorradiografía y microincineración para el estudio de depósitos metálicos, entre otras.



Glioxal y Glutaraldehído: ambos son dialdehídos que actúan sobre las proteínas, asegurando su máxima preservación química y espacial. Sus potenciales de oxidación están próximos al formol. Son compuestos miscibles en agua y el poder de penetración es mayor, a pesar que los pesos moleculares de estos son mayores que el correspondiente al formol. Generalmente, se preparan en soluciones diluidas a pH fisiológicos. Fija correctamente proteínas y estructuras celulares y de matriz asociadas a ellas, tales como ADN y membranas. En el caso del glutaraldehído se emplea, más bien, en microscopía electrónica diluido en buffer de cacodilato de sodio. El glioxal al 5% en buffer de fosfatos a pH 7,4 tiene aplicación reciente en microtécnica de rutina.




Tetróxido de osmio: su fórmula química es: O4Os, se ioniza con dificultad y la solución al 2% tiene un potencial de oxidación de 0,64 volt. Es un fijador aditivo que preserva, preferentemente proteínas y lípidos. En el primer caso, este óxido se une a los grupos aminos cercanos de las proteínas a modo de puente, produciendo un reticulado estable de difícil disolución. En el caso de los lípidos se une en las dobles ligaduras, tal como lo hacen los metales bivalentes. Colorea de negro el ácido oleico y las oleínas; mientras que el ácido palmítico, esteárico, sus ésteres y los glicéridos se tiñen de color marrón intenso (en realidad, estas sustancias se encuentran mezcladas en el tejido, por tanto, se dice que los lípidos se colorean de oscuro).

No presenta reacción alguna con hexosas, pentosas o sus polímeros, por tanto, no se emplea para fijar carbohidratos. Preserva muy bien la estructura celular, a pesar de la pérdida de homogeneidad alrededor del núcleo, a menos que se realice una fijación previa con algún aldehído, tal como se emplea en microscopía electrónica. Penetra lentamente (K: 0,85 en 25 horas), o sea que a medida que el osmio penetra su constante K se hace todavía menor. La contracción que se produce es poco significativa, más bien, ablanda el tejido a tal punto que durante la obtención de los cortes, el tejido se disgrega. El tetróxido de osmio tiene 9 estados de oxidación y, por los menos, 5 son reactivos con componentes celulares. El osmio es soluble en medios polares y no polares, por tanto, puede fijar sitios polares y apolares en lípidos y proteínas, de acuerdo a lo mencionado con anterioridad. El osmio al reaccionar con estos componentes es reducido, originando un precipitado insoluble, difícil de extraer y electrodenso, que lo hace muy adecuado para aumentar el contraste de la ultraestructura del tejido.






Fijación por formación de Sales


Las sustancias que fijan por formación de sales son aditivas y de penetración lenta. El fenómeno de fijación se produce por el establecimiento del anión o catión salino en lugares específicos de las moléculas del tejido, a través de uniones iónicas. Estas uniones entre sitios proteicos o lipídicos y los iones metálicos producen liberación de moléculas de agua a partir del tejido, el cual tiende a endurecerse y, por ello, se deben utilizar mezclados con otras sustancias fijadoras.


Bicloruro de mercurio: su fórmula química es Cl2Hg y se lo emplea, generalmente, en solución acuosa al 5%. Esta solución tiene un pH aproximado a 3.0 y su potencial de oxidación es 0,75 volt. El Hg es un metal bivalente que se adiciona a sitios insaturados de lípidos y a puentes disulfuros en proteínas con gran especificidad, provocando la preservación de estos componentes tisulares. Sin embargo, el precipitado excesivo de este metal se observa en la preparación histológica final como partículas negras y amorfas que se deben redisolver en el corte de tejido antes de la coloración, utilizando una solución débil de Lugol y luego otra de tiosulfato de sodio (S2O3Na2) para eliminar el iodo (se puede reemplazar por hiposulfito de sodio: S2O4Na2). En el siguiente esquema se representan 2 grupos laterales de Cisteína unidos a un átomo de Mercurio (Hg). Coagula fuertemente las proteínas que contienen principalmente metionina o cisteína. Sin embargo, sobre el lado ácido del punto isoeléctrico de la mayor parte de las proteínas biológicas se une a los grupos aminos (-NH2) y, por el lado básico, se liga a los grupos carboxilos (-COOH). Precipita los ácidos nucleicos. Los triglicéridos se fijan correctamente pero se colorean menos con colorantes Sudán; los ácidos grasos (palmítico y esteárico) se hidrolizan con facilidad a compuestos plasmales que se colorean inespecíficamente con el reactivo de Schiff (reacción plasmal). Provocan buena fijación de citoplasmas y los componentes nucleares adoptan una malla poco uniforme. Las inclusiones citoplasmáticas no presentan distorsión, aunque sufren difusión hacia la membrana plasmática.



Dicromato de potasio: se lo utiliza en solución acuosa al 1,5% y su fórmula molecular es Cr2O7K2. A esa concentración tiene un pH de 3,9 y su potencial de oxidación en moderado (0,79 volt.). Durante su disolución origina los aniones dicromato y cromato hidrogenado, los cuales permiten la correcta preservación de lípidos y proteínas respectivamente. Penetra lentamente otorgando al tejido una rigidez que favorece el seccionamiento con micrótomo. Las proteínas se fijan por coagulación, los ácidos nucleicos tienden a disolverse; mientras que las histonas nucleares son fuertemente gelatinizadas. En el caso de los lípidos son atacados por sus dobles ligaduras y los vuelve más resistentes a los solventes orgánicos. Los ácidos grasos de cadena corta que presentan una doble ligadura próxima al grupo carboxilo terminal polimerizan tras oxidación, lo que permite su preservación en el tejido. En el caso de los ácidos grasos muy insaturados, se producen dicetonas que luego se “croman” motivando su estabilidad. Las trioleínas se fijan si la acción del fijador es prolongada. Las muestras fijadas con este reactivo presentan un precipitado verdoso y, por ello, se deben lavar con agua común a fin de evitar coloraciones inadecuadas.




Acido crómico: se lo emplea en bajas concentraciones (0,5%). Su fórmula química es CrO3 y su potencial de oxidación es 1,08 volt. Se lo recomienda para preservar lípidos, ya que actúa de la misma forma que el dicromato de potasio. Sin embargo, no es buen fijador para el resto de las estructuras histológicas debido a su elevado poder oxidante. Tras la fijación, las muestras se deben lavar con agua común para eliminar el color amarillo verdoso que presentan.



Acido pícrico: es soluble en agua, alcohol y benceno. Fija con contracción de la muestra, si bien el endurecimiento es escaso. La solución acuosa saturada tiene un pH de 1,6 y su potencial de oxidación es de 0,82 volt. Coagula las proteínas originando picratos salinos del aminoácido al que se une. Fija bien los ácidos nucleicos y forma una malla homogénea en el núcleo, lo que permite gran estabilidad espacial de sus componentes. Los hematíes se vuelven esféricos. Si se desea realizar tinciones in toto o en bloque no se recomienda el uso de soluciones acuosas (pironina), sino alcohólicas (safranina). El tiempo de fijación oscila según el tamaño de la muestra entre 6 y 40 horas a temperatura ambiente. Por otra parte, el ácido pícrico tiene acción descalcificadora y, por ello, se debe evitar el uso de este ácido como fijador cuando se investiga la presencia de calcio en la muestra (técnica de von Kossa, Alizarina S, etc.). Tras utilizar este reactivo, las muestras biológicas se deben lavar en varios baños de alcohol etílico de 70º.





Sulfato de zinc: durante mucho tiempo se pensó que esta sustancia actuaba como un reactivo indiferente, tal como sucede con el cloruro de sodio, sulfato de sodio o potasio. Sin embargo, en la actualidad se lo emplea para la preservación de lípidos de membranas celulares y componentes de lámina basal y aquí es donde se observan los beneficios que esta sustancia presenta. Asimismo, se lo utiliza para fijación de proteínas tisulares en diferentes protocolos inmunohistoquímicos. Se lo usa en bajas concentraciones (0,5%) y su fórmula es SO4Zn. El potencial de oxidación es bajo (0,45 volt.) y, por tanto, actúa suavemente sobre membranas, aunque con ligera contracción de la muestra.




Fijación por Cambio de Estado Coloidal


Todos los reactivos citados anteriormente provocan pérdida de agua a partir del tejido. Por tanto, mientras se produce la fijación de las estructuras tisulares, el agua tiende a salir del tejido haciendo que los componentes moleculares pasen del estado de sol al estado de gel. El cambio de estado coloidal hace referencia, más bien, al reestablecimiento del contenido de agua en el tejido, asegurando imágenes microscópicas más reales.



Acido acético: rara vez se lo utiliza solo, ya que se obtienen resultados inadecuados. Por el contrario, este reactivo tiene excelentes ventajas cuando es adicionado a otros líquidos fijadores, situación que se realiza frecuentemente. Su fórmula es CH3-COOH y la concentración óptima es al 5%. Tiene un potencial de oxidación moderado (0,77 volt.); por lo tanto es un oxidante que se reduce a acetaldehído durante la fijación. El pH es 2,32 y su constante de disociación (1,80 x 10-5), lo cual indica que tanto el ácido disociado como el no disociado se unen a nivel de los grupos aminos y carboxilos vecinos de los aminoácidos laterales de las proteínas. El grupo hidrofílico resultante atrae moléculas de agua provocando un balance hídrico positivo que contrarresta la actividad deshidratante de los demás fijadores. Durante la solvatación del anión acético se originan iones hidronio (H3O+) que tiene un efecto preservador de las estructuras hísticas por inhibición de la actividad enzimática proteolítica local. Produce separación de agregados celulares. El citoplasma se fija homogéneamente, el núcleo se retrae ligeramente, mientras que el ADN se preserva correctamente. Los gránulos neutrófilos de los polimorfonucleares tienden a disolverse. Ciertos lípidos son miscibles (colesterol, esfingomielinas y ricinoleínas). Sin embargo, si se lo utiliza a la concentración indicada, no los afecta demasiado. Los fosfolípidos forman soluciones coloidales. Los hidratos de carbono no se fijan pero tampoco son disueltos. Las mitocondrias se vuelven ligeramente granulares.






Para Comentarios y Foros de Debate ir a página principal.








5 comentarios:

  1. Me gustaria saber cuales son tus referencias, ya que la información esta muy buena jajaja

    ResponderEliminar
    Respuestas
    1. Hola... en Google podrás ver mis publicaciones en revistas científicas nacionales e internacionales.. gracias

      Eliminar
  2. Respuestas
    1. Hola... como ves las páginas hacen link entre varios blog de mi autoría...., en el de Reactivos está toda la bibliografía consultada para toda la red de mi trabajo. Asimismo, en Google podrás ver lfa variedad de mis publicaciones en revistas científicas nacionales e internacionales, que respaldan mis escritos. Gracias por tu interés. Víctor Hugo. Mi email es vhtmagno@gmail.com por cualquier consulta.

      Eliminar
  3. Caesars Entertainment, Inc. casino: how is Caesars Entertainment, Inc.
    여주 출장마사지 › Casino 사천 출장샵 › › Casino 충청남도 출장마사지 The casino is located on the Las 삼척 출장샵 Vegas Strip. Caesars Entertainment is known for creating world-class slots and games, live dealer games, and more. 과천 출장안마

    ResponderEliminar